1．引物
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯配）。
引物的選擇將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計也極大的影響擴增產(chǎn)量：若使用設(shè)計粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒有；而使用正確設(shè)計的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。
（1）引物長度
PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。引物的長度一般為15-30bp，常用的是18～27bp，但不應(yīng)大于38bp。引物過短時會造成Tm值過低，在酶反應(yīng)溫度時不能與模板很好的配對；引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶反應(yīng)的*適溫度，還會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)，而且合成長引物還會大大增加合成費用。
（2）引物堿基構(gòu)成
引物的G+C含量以40～60%為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5～10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55～80℃，其Tm值*好接近72℃以使復(fù)性條件*佳。引物中四種堿基的分布*好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
（3）引物二級結(jié)構(gòu)
引物二級結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體，應(yīng)控制其ΔG大于-5.0 kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3’端或近3’端對引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。
（4）引物3’端序列
引物3’末端和模板的堿基*配對對于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3’末端*后5到6個核苷酸的錯配應(yīng)盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應(yīng)的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。
引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補，尤其是在3’末端。引物間的互補將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴增成功。
引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，此值的大小對擴增有較大的影響。應(yīng)當選用3’端?G值較低（**值不超過9），負值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
需要注意的是，如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。另外末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3’端使用堿基A。
（5）引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。對于引入一至兩個酶切位點，應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計完畢后確定，便于后期的克隆實驗，特別是在用于表達研究的目的基因的克隆工作中。
（6）引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源，特別是與待擴增的模板DNA之間要沒有明顯的相似序列。
2．酶及其濃度
Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶，是從水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中分離的。Taq DNA聚合酶是一個單亞基，分子量為94 000 Da。具有5’-->3的聚合酶活力，5’-->3’的外切核酸酶活力，無3’-->5’的外切核酸酶活力，會在3’末端不依賴模板加入1個脫氧核苷酸（通常為A，故PCR產(chǎn)物克隆中有與之匹配的T載體），在體外實驗中，Taq DNA聚合酶的出錯率為10-4～10-5。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。
此酶具有以下特點：
（1）耐高溫，在70℃下反應(yīng)2小時后其殘留活性在90%以上，在93℃下反應(yīng)2小時后其殘留活性是仍能保持60%，而在95℃下反應(yīng)2小時后為原來的40%。
（2）在熱變性時不會被鈍化，故不必在擴增反應(yīng)的每輪循環(huán)完成后再加新酶。
（3）一般擴增的PCR產(chǎn)物長度可達2.0 kb，且特異性也較高。
PCR的廣泛應(yīng)用得益于此酶，目前各試劑公司中開發(fā)了多種類型的Taq酶，有用于長片段擴增的酶，擴增長度可達40kb；有在常溫條件下即可應(yīng)用的常溫PCR聚合酶；還有針對不同實驗對象的酶等。
一典型的PCR反應(yīng)約需的酶量為2.5u（總反應(yīng)體積為50ml時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3．dNTP的質(zhì)量與濃度
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200mmol/l，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。
4．模板（靶基因）核酸
模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑（酚與氯仿抽）抽提除去蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸，該核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。
模板DNA投入量對于細菌基因組DNA一般在1~10ng/l，實驗中模板濃度常常需要優(yōu)化，一般可選擇幾個濃度梯度（濃度差以10倍為一個梯度）。在PCR反應(yīng)中，過高的模板投入量往往會導(dǎo)致PCR實驗的失敗。
5．Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200mmol/l時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。一般廠商提供的Taq DNA聚合酶均有相應(yīng)的緩沖液，而Mg2+也已添加，如果特殊實驗應(yīng)采用無Mg2+的緩沖液，，在PCR反應(yīng)體系中添加一定量的Mg2+。
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